3Dペーパー - 株式会社リレー

Scientific Reports volume 12、記事番号: 13657 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

牛乳の異物混入は発展途上国でよく見られる問題であり、人間に致命的な病気を引き起こす可能性があります。牛乳サンプル中のさまざまな混入物を特定するためのいくつかの研究にもかかわらず、複数の混入物の影響はまだ解明されていません。この研究では、牛乳中の複数の化学異物を同時に検出するために、三次元 (3D) 紙ベースのマイクロ流体デバイスが設計および製造されています。この装置は、上部カバー、下部カバー、および輸送ゾーンと検出ゾーンで構成される中間層で構成されます。中間層のサポートに切り込みを入れることにより、デバイスの流路は最適かつ均一な速度を特徴とします。初めて、牛乳サンプルから 7 種類の混入物 (尿素、洗剤、石鹸、デンプン、過酸化水素、炭酸水素ナトリウム、塩) が同時に検出され、同時に特異性評価と詳細な色彩干渉分析が行われました。一度に 7 種類の異物を検出するには、わずか 1 ～ 2 mL のサンプル量が必要です。比色反応には試薬の体積のうちわずか 10 $\upmu$L を使用し、結果は数秒以内にわかりました。観察により、比色分析を使用した混入物の検出限界 (LOD) が $0.05\%$ (vol./vol.) ～ $0.2\%$ (vol./vol.) の範囲にあることが明らかになりました。検出技術。実験結果から得られた検量線を用いて、添加された未知の異物の量を測定します。ここでは、プロセスの再現性と再現性、感度、検量線の検出の直線範囲、および色強度データの統計的研究が徹底的に分析されます。このシンプルでポータブル、そしてユーザーフレンドリーな 3D マイクロ流体デバイスは、リソースが限られた環境においても、消費前の流動食品のテストに使用されることが期待されます。

食品の異物混入は世界中で深刻な問題であり、人々の健康に危険を及ぼすため、食品安全当局から大きな注目を集めています。牛乳は、インド、パキスタン、中国、ブラジルを含む世界の牛乳総生産量の約半分を占める発展途上国で最も異物が混入した食品の一つです。一人当たりの牛乳の利用可能量は年々増加していますが、現在の増加率と必要とされる牛乳生産の増加率の間には大きな隔たりがあります。牛乳は、たんぱく質、脂肪、炭水化物、ビタミン、ミネラルなどが豊富に含まれる低価格の栄養価の高い食品であるため、消費量が多くなります。混和物を添加すると、需要と供給のギャップを埋めることで乳製品事業の利益が高まります。この汚染は、より多くの合成乳を生産することで乳消費者のニーズを満たすための利用可能な手段の 1 つであると考えられます1。

牛乳は、尿素2、3、4、メラミン5、6、洗剤7、ホウ酸8、ホルマリン9、硫酸アンモニウム、石鹸、塩、中和剤10、マルトデキストリン11、デンプン、糖類12、クレンブテロール13、テトラサイクリン14、過酸化水素15、カラメル、水16、17、およびその他多くの有害物質18. これらの化学物質は安価で広く入手可能です。厳格な施行法の欠如と、迅速かつ簡単な検出技術の欠如が、この問題を制御する上での大きなボトルネックとなっています。牛乳の品質は通常、脂肪率、SNF (無脂肪固形物) 値、タンパク質含有量、およびその他の要因によって決まります19。これらのパラメータを改善するために、通常、混和物が牛乳に追加されます1。牛乳に水を加えて体積を増やします。対照的に、尿素とメラミンは牛乳中の非タンパク質窒素含有量を増加させます。洗剤と石鹸はミルクの白さを増し、加えられた油を乳化させます。過酸化水素、塩、ホルマリンは牛乳の保存に使用されます。砂糖とでんぷんは希釈した牛乳の密度を高めるために使用され、炭酸水素ナトリウムと炭酸ナトリウムは牛乳の酸性度を中和するために使用されます。世界保健機関 (WHO) およびその他の食品安全当局のガイドラインでは、これらの化学物質の安全な摂取制限が指定されています20。牛乳中の尿素の安全限界は 70 mg/100 mL です21。過酸化水素とデンプンの最大残留限度 (MRL) は、それぞれ $0.05\%$ v/v と $0.15\%$ v/v です22。洗剤と石鹸の安全限界は 0.002 mg/kg 未満です23。インド食品安全基準局 (FSSAI) によると、牛乳にはいかなる量の塩や炭酸塩も含まれてはなりません24。これらの汚染物質を安全限度を超えて摂取すると、腎不全、乳児の死亡、胃腸合併症、下痢、腎不全、さらには人間の癌などの有害な病気を引き起こす可能性があります21。

ラクトメーター密度検査、凝固点検査、ケルダールタンパク質検査 25、ガーバー脂肪検査など 26 などのさまざまな実験室ベースの技術が、牛乳のさまざまな特性を特徴付けるために長い間使用されてきました。しかし、これらのプロセスでは、化学的異物の大部分を検出することはできません。研究者は、高速液体クロマトグラフィー (HPLC)、赤外分光法、質量分析、電気化学信号分析、蛍光、アドミッタンス、ナノ粒子による比色検出など、さまざまな混入物に対するさまざまな検出技術を開発してきました27、28、29、30、31。、32、33など。一方で、これらの機器を使用した臨床検査は費用がかかり、多くの場合、時間がかかります。さらに、これらの方法には、重量、可用性、エネルギー消費、スキル要件などの欠点があります。したがって、この研究の動機は、家庭環境を含むさまざまな環境で使用できる、低コストでアクセス可能なデバイス 34 を設計および製造することです。

紙ベースのマイクロ流体技術は、牛乳中の混入物検出に関連して上記の欠点に対処するための潜在的な代替手段となる可能性があります35、36、37、38。紙ベースのマイクロ流体アプローチは、比色検出に基づいて、さまざまな液体食品サンプル中の重金属 39,40、抗体 41、二酸化硫黄 42、安息香酸 43、D-グルコース 44、ホルムアルデヒド 9、およびその他の化合物を検出するために使用されてきたと報告されています。 Whitesidesら45は、尿サンプル中のグルコースとタンパク質を検出するための紙ベースの装置を作成した。流れに適切な方向を与えるために、著者らはクロマトグラフィー紙を疎水剤でコーティングし（SU-8 2010）、続いて UV 光にさらしてチャネルを親水性にしました。しかし、彼らの研究で採用されたフォトリソグラフィー技術は高価で複雑です。したがって、研究者は、ワックス印刷47、レーザープリンターを使用したトナーインク印刷48、疎水性紙のプラズマ処理49、3D印刷50、$TiO_2$51,52を使用した濡れ性パターニング、疎水性ペン53の使用など、疎水性バリアを作成するためのより簡単な方法46を開発しました。さらには修正ペンを使用することもあります54。紙のテストカードは、親水性の検出スポットを作成することによるスポットテスト分析を使用して、牛乳中の尿素、デンプン、グルコース、およびその他の混入物を検出するために作成されます12,55。ワックス印刷技術56、57、58、PDMSコーティング59、60などを使用して、疎水性バリアが作成され、親水性の円形ゾーンに化学試薬が保管されます。数分後、比色反応が携帯電話でキャプチャされ、画像分析を使用して添加された混和物の量が決定されました39、43、44、61、62。これらの方法には、解像度が低い、コストが高い、ワックスプリンターが利用できない、疎水性バリアの強度、同時検出ができないなどの欠点があります。一方、インクジェット印刷法 63 は簡単、迅速、安価ですが、バリア強度が不十分で、さまざまな液体サンプルの検出ゾーン内の試薬の流れを制限できません。疎水性バリアを製造するこれらのさまざまな方法は、簡単な製造技術を開発するための研究の重要性を示しています。前述したいくつかの利点にもかかわらず、紙ベースのデバイスにはいくつかの問題があります。紙の多孔質構造により、液体が全方向に広がるため、液体の目的の場所への輸送が低下することがよくあります。紙ベースのマイクロ流体デバイスに関連するその他の欠点としては、蒸発によるサンプルの損失、サンプルの前処理ステップ、低感度、高 LOD、保管試薬の保存寿命の短さ、そして最も重要なことには商業化の欠如が挙げられます 64。

今回我々は、少量の液体サンプル (1 ～ 2 mL) を使用して液体サンプル中の複数の異物を同時に検出できる、3D でポータブルな低コストの紙ベースのマイクロ流体デバイスの新しいデザインを作成しました。液体の流れは、固有の毛管作用により多孔質紙基材内で引き起こされます。（超）疎水性コーティングが使用されていないため、このデバイスは耐久性があり、多くの液体食品の異物検出に使用できます。特許取得済み (出願番号 345721-001) の 3D デバイス設計により、液体の流量が純紙基材の流量と同じに保たれます。紙基材上の液体の流れの抵抗を減らすために、中間の支持層にいくつかの切り込みが入れられており、液体の流れの速度は純粋な紙の場合と同じままです。比色検出技術により検出ゾーン内の混入物が特定され、色の強度テストを使用して定量分析が行われています。私たちは、この装置が牛乳サンプル中の尿素、洗剤、石鹸、デンプン、過酸化水素、炭酸水素ナトリウム、塩を同時に検出できることを初めて実証しました。特許取得済み (出願番号 202141024502) の牛乳サンプルの混入物同時検出技術は、1 つの混入物を特定するために複数の実験が必要な従来の単一ストリップベースの検出よりも優れています。牛乳に添加された混和物の量は、色強度試験を使用して定量化されます。検出限界は、さまざまな混和物に対して $0.05\%$ (vol/vol) から $0.2\%$ (vol/vol) の範囲です。デバイス。迅速かつ簡単な製造技術により、このデバイスはリソースが限られた環境での使用に適しています。このデバイスの設計は拡張性があり、検出スポットの数を簡単に変更できます。さらに、デバイスの現在の設計を使用して、既存の機器ベースの検出技術に近い検出限界を発見しました。したがって、このデバイスは、技術面 (ASSR) とユーザー受け入れ (UED) の両方の側面に対処することで、ASSURED (手頃な価格、高感度、特定性、ユーザーフレンドリー、迅速かつ堅牢、機器不要、必要な人に届けられる) 基準を満たします。一緒に。

比色分析技術による紙ベースのマイクロ流体システムを使用して、さまざまな混入物を検出します。表 S1 は、さまざまな混入物の存在下での検出ゾーンの色の変化を示しています。図 1 は、添加された混和物の濃度が増加するにつれての色の変化を示しています。この図は、混入物の濃度が増加すると、特定の色の強度も増加することを示しています。検出ゾーンに不均一な色のパターンが現れるのは、溶媒蒸発後の化学試薬の堆積によるものです。蒸発流束と内部マランゴニ/浮力流を制御して検出ゾーンに均一なカラーパターンを作成することは、この研究の範囲を超えています。ただし、円形スポットの半径に沿った色の強度の変化を図S1に示します。最も低い濃度ではあまり変化がないのに対し、より高い濃度では色の変化が大きくなることが容易にわかります。いくつかの混和物では、色の強度が中心から半径方向に減少することがわかりました。ただし、過酸化水素と尿素では中心から半径方向に向かって強度が増加します。追加の混入物の量を定量化するために、色強度テストが使用されます。化学物質をスポットテストプラットフォームに保持するために、紙上に小さな円形の親水性スポットが生成されます。次に、純粋な牛乳をさまざまな量の混ぜ物 ($\rho$) と混合し、注射器を使用して円形のスポットに注ぎます。すべてのスポットには 10 $\upmu$L の試薬と 20 $\upmu$L のサンプルが含まれています。尿素、洗剤、でんぷん、塩、$H_2O_2$、$NaHCO_3$、石鹸はすべて室温でテストされます。サンプルが試薬と接触するとすぐに、検出スポットの色が変わりました。混入物の存在下でも、検出スポットの色が変化するまでの時間遅延はありません。同じ濃度での色の強度の再現性を確認するために、強度値に対して Anova テストを実行しました。表 S2 では、色強度値のすべての平均値が同じであると考える帰無仮説が受け入れられる一元配置分散分析検定の概要を示しています。

さまざまな濃度の混和物に対する比色反応後の色の変化が、すべての混和物について示されています。

色強度曲線は、(a) 尿素、(b) デンプン、(c) について牛乳に添加された $0.05\%$ から $1\%$ (v/v) までのさまざまな濃度の 8 つの異なる混和物について示されています。塩、(d) 洗剤、(e) 過酸化水素、(f) 石鹸、および (g) 炭酸水素ナトリウム。図から、濃度が増加するにつれて色の強度も増加していることが明らかです。

検出ゾーンの平均色強度 (I) は、画像処理技術を使用して決定されます。 ImageJ アプリケーションを使用すると、赤 (R)、緑 (G)、青 (B) の強度値が取得されます48。正規化された灰色強度値は、塩を除くすべての混和物について式 1 を使用して計算されます。 (1) および塩の場合は式 (1) を使用します。 (2)。

さまざまな濃度 ($\rho$) によるさまざまな混入物のすべての色強度曲線を図 2 に示します。ほとんどの状況 (塩を除く) では、色の変化が低い (茶色) から高い (白色) 強度に起こります。 )、逆強度値 ($I '=255-I$) を使用して、特定の色が高強度から低強度の色に移行するときに昇順で描写しました。これらの色強度曲線を使用して、牛乳に添加された未知の量の混和物の定量的調査を行いました。表 S3 には、色強度グラフからの曲線フィッティング $(R^2>0.95)$ によって発見された検量線が含まれています。ただし、定量分析を実行するために、図 2 に示す古典的な線形回帰フィット曲線を使用しました。異なる濃度ごとに 5 回実験を繰り返すと、色強度曲線が形成され、エラーバーは濃度の標準偏差として表されます。複数の実験。色の強度分析の詳細については、エラー分析のサブセクションで説明します。

予測された動作範囲の直線性は、すべての検量線について検証する必要があります。私たちの研究のほとんどのケースでは、線形範囲はダイナミックレンジと同じであるため、このプロセスにより、より正確で精密なデータが得られます65。ほとんどの場合、回帰値が $0.05\% (v/v)$ から $1\% (v/v)$ の範囲で 0.9 を超えるため、曲線は直線になります。線形範囲研究の詳細な調査を図 2 に示します。ここでは、比色反応から定性的に可視検出限界 (LOD) について言及しました。色の変化の強度は、図 2 に示す ImageJ を使用して特定されます。各ケースの色の強度の最小の顕著な変化は、デバイスの LOD と見なされます66。私たちは、比色検出法を使用したこれらの混入物の LOD が従来の方法の LOD とほぼ同じであることを発見しました。線形応答の感度と既存プロセスの LOD と現在の研究との比較を表 1 にまとめます。ただし、フィールドベースのアッセイにデバイスを使用するには、LOD を最大値としてさらに改善する必要があります。残留限界 (MRL) は紙ベースのデバイスの LOD 未満です。この装置は、牛乳サンプル中の非常に微量の混入物を検出するには十分な感度がありません。デバイスの感度をさらに向上させるために、電気化学的および比色検出と統合することができますが、これはこの研究の将来の範囲です。

色の濃さの経時的な安定性もテストされます。 30 分の開始時と終了時のすべての検出ゾーンの色の強度の違いを図 3 に示します。 30 分の時間間隔では、過酸化水素混入物の場合、開始時と終了時の色の強度の最大差が $4.8\%$ であることが観察されました。これらの結果から、ユーザーはテストを実行するためにしばらく経ってから画像を撮影できるため、即時の画像撮影がなくても結果に影響を与えないことが明らかです。

ここでは、1 分間と 30 分間の検出ゾーンの色強度値が示されています。

(a) コンパクトなデバイスの概略図。サンプルは、テストのために上部カバーの穴を通してデバイスに追加されます。 (b) デバイスの詳細ビュー。ここでは、上部カバー $(L_1)$、3D 紙ベースのマイクロ流体デバイス、下部カバー $(L_2)$ の 3 つの層が示されています。 (c) 二重層 3D 紙ベースのマイクロ流体デバイスがここに示されています。固体支持体を2層の濾紙で挟んだサンドイッチ構造です。 $L_3$ は輸送ゾーンを表し、$L_4$ は固体プラスチック層を表し、$L_5$ は検出ゾーンを表します。 (d) 底カバーの裏側のデザイン。混入物の名前と色のバンドは、定性的および定量的な識別のために与えられます。 (e) 3D 紙ベースのマイクロ流体デバイスを使用した 7 つの混入物の同時検出の画像が示されています (中間層のみ)。

3D設計を行って装置を製作し、複数の異物混入試験を同時に実行します。 3D デバイスの概略図を図 4 に示します。図 4a はコンパクトなデバイスの概略図を示し、図 4b、c はデバイスの詳細図とサンドイッチ構造の中間層をそれぞれ示します。図 4d は、底部カバーの設計を示しています。図4eには、中間層で7つの異物の同時検出が実行される実験画像が示されています。試薬の特異性とさまざまな混入物の色の強度に対する干渉の影響を研究することは、3D デバイスで混入物を同時に検出するために重要です。特異性分析のために、各反応ゾーンに 1 つの特定の混和物を追加しました。検出ゾーンに加えて、試薬を保管しないコントロールゾーンを作成しました。私たちは、純粋なサンプルと異物が混入したサンプルの対照ゾーンの色の強度の変化がほとんど無視できることを発見しました。その結果、対照ゾーンの牛乳サンプルは真っ白に見えるため、色強度値が 255 であると仮定しました。特定の混入物のみ、特定の場所で色の変化があることがわかります。図 5 は、すべての混入物の詳細な特異性研究を示しています。すべての実験は $25 \pm 2$ $^\circ$C の温度で行われます。それぞれの混入物を個別に使用して、蒸留水で混入サンプルを調製し、それらをデバイス上のすべての検出スポットに追加します。これらの結果に基づいて、試薬は他の化学物質の存在下でも色を変えないため、試薬は単一の混入物または混入物のグループに特異的であると結論付けることができます。また、純粋な牛乳を使用して、検出スポットの色の変化があるかどうかを確認しました。ただし、試薬は純粋な牛乳の色には影響しません。これらの試薬は純粋な乳成分とは反応せず、混和物が存在する場合にのみ反応し、その後色が変化します。したがって、色の干渉試験は、それらの少数の混入物のみを考慮して実行されます。干渉試験により、複数の混入物の干渉効果により、同時検出時の色の強度の変化がほとんどないことがわかりました。干渉試験では、同量の混和物を添加して、同じ体積の 2 つの異なる牛乳サンプルを調製します。あるサンプルではすべての混和物が混合されていますが、別のサンプルでは 1 つの混和物のみが追加されています。次に、混合物と単一の混和物を比色検出して、色の強度の変化を測定します。図 S2 は、混入物の混合物と単一の混入物の両方についての混入物の比色検出を示しています。図 6 は、単一の混入物と混入物の混合物の色強度値の違いを示しています。色の干渉は、単一の分析物の強度と混入物の混合物の色の強度の差として定義されます。色の強度を比較すると、色の強度に対する混入物の干渉効果が大幅に小さいことがわかります。その妥当な特異性と干渉による色強度のわずかな変化の結果として、紙ベースのマイクロ流体プラットフォーム上で混入物の同時検出が完全に可能です。

特異性試験の実験結果。 (a) 試薬のみが異なる検出ゾーンに表示されており、数字は尿素 (2)、$H_2O_2$ (3)、石鹸 (4)、塩 (5)、$NaHCO_3$ の検出ゾーンを表します。 (6)、洗剤 (7)、でんぷん (8)、および対照 (1)。試薬の特異性は、(b) デンプン、(c) 尿素、(d) $NaHCO_3$、(e) $H_2O_2$、(f) 洗剤、(g) 石鹸、および (h) に対して示されています。塩。

混和物混合物と単独の混和物との色の濃さの違いがここに示されています。最大干渉は、過酸化水素では約 $30\%$ で見られますが、他のすべての場合では $10\%$ 未満です。

実験は 3D $\mu$PAD を使用して、複数の異物を 1 ステップで同時に検出するために実行されます。図 4e は、単一のデバイスでの複数の異物の比色検出を示しています。サブミクロン量のサンプルの分注には専用のセットアップが必要となり、デバイスのコストが増加する可能性があります。また、運用コストが増加するため、知識のあるユーザーにとっては役立つ可能性があります。一方、比色検出には特定の量の試薬が必要です。サンプルまたは試薬の量が少ない場合、期待される明確な色の変化は感知できません。したがって、数回の試行を経て、この研究ではすべての検出スポットに 10 個の $\upmu$L 試薬を使用しました。牛乳サンプル中の混入物を同時に検出するために、平均量 1.5 mL の牛乳がさまざまな実験で使用されます。ただし、サンプル/試薬の量を最適化するには今後の研究が必要であり、正確な量のサンプルを簡単に測定して分注するために、対応する設計変更を実装する必要があります。色の変化は通常、サンプルが検出ゾーンに入るとすぐに起こることがわかります。前述の図 2 に示す検量線を使用して、定量分析のために牛乳サンプル中の混和物の添加量を決定しました。牛乳を装置に分配する前に、さまざまな量の混和物が牛乳サンプルに追加されます。比色反応後、カメラを使用して画像を撮影します。これらの画像から色の強度が抽出され、補正方程式に入力されて追加量が計算されます。図 2 に記載の検量線では、X は乳中に検出された混和物のパーセント (v/v) を表し、Y は比色反応後の検出スポットの色強度値を表します。表 2 は、添加された混和物の実際の量、検量線の結果、および装置の精度の比較を示しています。関係14,40,71,72, $RT = \frac{\text {回復量}}{\text {追加量}}\times 100\% を使用して、ペーパーデバイスの回復率 (RT) を取得しました。 $。この装置を使用すると、複数回の実験後、添加された混和物の回収率は 85 ～ 107% の範囲にあり、再現性は 0.50 ～ 3.51% (RSD = 相対標準偏差) であることがわかります。色強度検出方法を使用することで、$80\%$ 以上の検出精度を達成しました。補足資料には、図S3に使用済みの小型デバイスの実画像が示されています。また、補足ビデオ S1 に、3D 紙ベースのマイクロ流体デバイスを使用した牛乳サンプル中の混入物の同時検出のビデオを追加しました。

最後に、3D 紙ベースのマイクロ流体デバイスの製造にかかるコストの見積もりが実行されます。化学薬品、紙、溶剤の特定の量の価格はわかっています。したがって、特定の量の合計コストを分割して、使用量のコストを決定しました。ワットマン濾紙 (グレード 4) 100 枚入りの箱の価格は、Rs です。 1300 ($16.39\$$) で、1 つのデバイスを作るのに 1 枚の紙を使いました。結果として、100万円の費用がかかります。 13 ($0.16\$$)。同様に、さまざまな溶媒を含む 10 mL の溶液を作成するために一定量の試薬が使用され、デバイスの作成にはその溶液のうち 10 $\upmu$L のみが使用されます。デバイス作成の価格は表 S4 にリストされています。溶媒の価格は試薬の価格に含まれています。コスト分析によると、デバイス 1 台のおおよその価格は Rs です。 17.70 ($0.23\$$)。従来の方法とのコスト、LOD、テスト時間の詳細な比較については、セクション 4 の補足文書で説明されています。 S8.

本研究では、紙ベース (ワットマン濾紙グレード 4) の装置を作製し、比色法に基づいて牛乳サンプル中の複数 (7 つ) の混入物を同時に検出するために使用します。観察の結果、各テストに必要なサンプル量は 1 ～ 2 mL のみで、テスト時間は 30 秒未満であることがわかりました。作成した検量線を使用して、回収率 85 ～ 107%、RSD 範囲 0.50 ～ 3.51% で定性分析と定量分析が実行されます。混和物の直線範囲、感度、LOD は既存の方法に近いです。 7 つの混入物を検査する費用はおよそ $0.23\$$ のみです。この方法は、牛乳中の混入物をその場で検出できる信頼性の高いものです。さらに、軽量、低コスト、使いやすく、環境に優しいため、この装置は多くの液体食品の検査に適しています。調査から、この方法では試薬は特定の混和物とのみ反応し、乳成分とは反応しないことが推測されます。したがって、この分析ツールは液体食品の安全性を監視するのに役立ち、それによって発展途上国の遠隔地における汚染された牛乳の追跡可能性を高めることができます。

なお、試薬を適切に変更することで、現在の装置は牛乳だけでなく、水、プロテインシェイク、フルーツジュースなどにも使用できます。さらに、将来的にはモバイルアプリケーションを使用して定量分析を実行することを目指しています。混入物の濃度を決定します。また、試薬の蒸発効果、さまざまな明るさでの色の強度を見つけるための共通プラットフォーム、人工知能を使用した未知の異物の検出など、開発されたデバイスの潜在的な制限への対処にも重点が置かれます。

パラ-ジメチルアミノベンザルデヒド (p-DMAB)、フェノールフタレイン、ブロモクレゾールパープル、ヨウ素溶液、重クロム酸カリウム、硝酸銀、ヨウ化カリウム、ロソリン酸、塩酸、エタノールなどの化学薬品は、Sigma Aldrich によって提供されています。尿素、過酸化水素、炭酸水素ナトリウム、ワットマン濾紙グレード 1 および 4 (長方形および円形)。石鹸、洗剤、でんぷん粉、塩、さまざまな牛乳サンプル ($3\%$ の脂肪を含む市販の調乳サンプル)、印画紙、PVC シート、その他の品目は地元の店から調達されます。すべての化学物質はさらに精製せずに使用されます。

すべての試薬は、その溶解度に応じて蒸留水またはエタノールに溶解します。比色検出技術を使用すると、さまざまな液体サンプル中のすべての異物が検出されます。尿素を検出するには、$10\%$ (v/v) 濃塩酸のエタノール溶液に溶解して $1.6\%$ (w/v) p-DMAB 溶液を調製します。石鹸と洗剤の検出には、エタノールに溶解した $1\%$ (w/v) フェノールフタレイン試薬溶液と、水に溶解した $0.5\%$ (w/v) ブロモクレゾールパープル溶液がそれぞれ使用されます。 $1\%$ (w/v) のヨウ素を $10\%$ (w/v) のヨウ化カリウム水溶液に加えてデンプンを検出します。塩の検出には、水に溶かした0.1N重クロム酸カリウム溶液と1N硝酸銀溶液を1滴混合して生成した沈殿を使用しました。 $H_2O_2$の検出には、水-エタノール(3:1 v/v)溶液に溶解した飽和ヨウ化カリウム溶液を使用します。炭酸水素ナトリウムなどの中和剤は、エタノールに溶解した $1\%$ (w/v) ロソリン酸溶液を使用して検出されました。比色反応をチェックするために、さまざまな化学物質を混入した後、汚染された牛乳を検出ゾーンに一滴加えました。尿素は酸性媒体中で p-DMAB と相互作用して黄色の化学物質を生成します (図 7a)。図 7 に化学反応の模式図を示します。さまざまな尿素濃度でこのテストを実行し、色の強度に違いがあるかどうかを確認しました。尿素濃度が増加すると、黄色の強度が増加することがわかりました。さまざまな混和物も牛乳に導入され、比色検出が実行されます。ヨウ素溶液はデンプンと結合して青色の化合物を生成します（図7b）。界面活性剤の存在下、ブロモクレゾール指示薬は酸性度の低い媒体中でインジゴの色合いを与え（図 7d）、塩は重クロム酸銀の沈殿と反応して白色の塩化銀の沈殿を生じます（図 7c）。過酸化水素が飽和ヨウ化カリウム溶液と結合すると、茶色のヨウ素化合物が形成されます（図7e）。石けんの存在下、酸性度の低い媒体中でフェノールフタレインはピンク色を帯び、炭酸水素ナトリウムがアルコール性ロソリン酸溶液と結合してピンクがかった赤色の分子を生成します（図7g）。すべての測定は、精度 1 mg の秤量天秤 (Pioneer、Ohaus)、計量ジャー、およびピペットを使用して実行されます。液体食品サンプルのテストには、蒸留水と調乳を使用しました。スポットテスト分析では、さまざまな濃度の混和物が 10 mL の液体サンプルに追加されます。複数の混入物を同時に検出するために、10 mL の牛乳サンプルにさまざまな混入物を加えました。牛乳にはより多くの固体化合物が添加されているため、その密度が増加し、したがって純粋な牛乳と比較してラクトメーターの測定値がはるかに高くなります。したがって、ラクトメーターの測定値が純乳と同等の値を維持できるように、サンプルに蒸留水を加えて希釈しました。サンプル調製の詳細は、図S4の補足文書に記載されています。

(a) 尿素73、(b) デンプン74、(c) 塩75、(d) 洗剤76、(e) $H_2O_2$77、(f) 石鹸78、および(g) $NaHCO_3$の比色反応の概略図）79。

スポットテスト分析を使用して色強度テストを実行し、測定の検出限界 (LOD) を決定しました。直径 16 mm の小さな円形パターンは、描画ソフトウェア AutoCAD 2021 を使用して作成され、市販の HP レーザープリンター (Laser Jet Pro MFP M227fdn) で印刷されます。円形ゾーンの直径は、液体の分散体積 (40 $\upmu$L) を円形ゾーンの高さと面積と等しくすることで計算されます。印刷された紙を疎水性にするには、紙の両面の孔を塞ぐ必要があります。そこで、紙をホットプレート (スピノット) 上で $170 \pm 1$ $^\circ$C で 20 分間加熱して、反対側の細孔をブロックします48。加熱によりインクが溶けて細孔を通って紙の反対側に広がりました。コーティングを安定させるために、紙シートを室温で 5 分間放置します。ゴニオメーター (Holmarc) を使用して疎水性バリアの接触角を測定したところ、$120\pm 2^\circ$ でした。

ユニバーサル $CO_2$ レーザーシステム (10.6 $\upmu$m $CO_2$ レーザー、出力 60 W) (最大速度 $3\%$ を使用、$3\%) を使用しました。紙の場合は最大出力の $、プラスチックの場合は最大出力の $11\%$ と最大速度の $2\%$) を使用して、紙を目的の形状に切断します。 3D 紙ベースのマイクロ流体デバイスは、上下のカバー ($100 \times 100$ mm$^2$) とサンドイッチ構造の中間層で構成されています。上部カバーにはサンプルを追加するための直径 10 mm の小さな穴が 1 つあります。底部カバーには、試行後の所見を検査するための複数の穴（直径 16 mm）があります。サンドイッチ構造ペーパーデバイスは、2層の紙の間に1層のプラスチック層をサンドイッチし、デバイスの強度を向上させます。上部の紙層には、サンプル入口点 (直径 10 mm)、一次トラック ($10 \times 6$ mm$^2$)、リングトラック (幅 5 mm)、二次トラックがあります。 ($5 \times 4$ mm$^2$)、および垂直輸送ゾーン (直径 16 mm)。プラスチック層は紙をサポートしており、速度を向上させてサンプルを紙の 2 番目の層に送るために、いくつかの切り込み ($10 \times 2$ mm$^2$) と穴 (直径 12 mm) があります (図) .S5)。最下層の紙層の検出ゾーン (直径 16 mm) には、検出剤がロードされます。輸送ゾーンと検出ゾーンをプラスチック層に接続するために、それぞれ両面テープと接着剤が使用されます。この 3D デザインは、より密度の高い液体を一定の速度で輸送するのに適しています。テストの数は、リングトラックのサイズを変更することで増やすことができます。テスト中、物質は上部カバーの小さな開口部 (1 ～ 2 mL) に注がれ、毛細管現象により紙のトラックを介して検出ゾーンに移動します。試薬の蒸発速度を抑えるために、デバイスの外側には透明なカバーが付いています。紙は試薬で処理され、乾燥させられます。乾燥後、両方の紙層を支持体の両面に貼り付け、カバーを両面テープで貼り付けます。一方では試薬を保管し、もう一方ではサンプルを保管します。液体の垂直移動により、サンプルは支持穴を通って別の層と接触します。検出ゾーンの画像は、焦点距離 105 mm のレンズを備えた DSLR カメラ (Nikon D750) で、一定のレンズ絞り f/4.5、ISO 1000、解像度 $2624 \times 3936$ を維持して撮影されます。毎回ピクセル。高い多孔性 (平均孔径 25 $\upmu$m) と厚さ (210 $\upmu$m) のため、この設計ではワットマン濾紙グレード 4 が使用されており、液体の流れを助け、より多くの試薬を保管するために。グレード 4 の濾紙とグレード 1 の濾紙 (主に研究で使用される、孔径 11 $\upmu$m、厚さ 180 $\upmu$m) の品質を、両方の濾紙で複数の液体流動実験を実行して比較しました。紙の種類。結果は、Whatman グレード 4 濾紙の方がグレード 1 よりも流れが速いことを示しています (図 S6)。

この設計を使用して、以前の研究の特定の欠点を克服しました。提案された 3D デバイスを使用して、複数の異物の同時検出が実行されます。現在のデバイス設計では、親水性パスやさまざまな円形スポットを作成するために疎水性材料は使用されていません。したがって、疎水性バリア強度が弱いため、試薬が装置から漏れるという問題はありません。私たちが提案する方法は、疎水性コーティングのステップを省略することで、簡単かつ拡張可能です。輸送と検出に2層の紙を使用することで、試薬の相互汚染を解決しました。 2 つの紙層の 3D 構造を作成するもう 1 つの利点は、紙の細孔の詰まりによって液体の流れが中断されないことです。 1 層の紙を使用して実験を実行すると、紙のチャネルを通る試薬の逆流が発生し、最終的に細孔が詰まります。そこで、液体サンプルの流れと試薬の貯留を2層に分けて行い、サンプルが上面から検出ゾーンに到達する3次元設計を採用しました。

3D デザイン (図 4c) では、上部の紙層が下部のプラスチック支持体に取り付けられており、その厚さは紙の厚さと同様です。そのため、紙の下側の抵抗力によって液体の流れを遮断する必要があります。 3 つの異なるケースの液体の流れを比較し、強度と速度の最適なケースを検討しました。紙片 ($30 \times 6$ mm$^2$) を採取し、紙保持装置を使用して複数の実験を実行します。液体は 30 秒以内に紙の水平セクション全体を流れるため、紙のみの場合には、従来の Lucas-Washburn 解析モデル (重力なし) が適用できます 16,80。このモデルでは、毛細管力と粘性抵抗力の間の力の平衡が考慮され、毛細管の高さ (L) は $L \propto t^{0.5}$ のように時間 (t) に関連付けられます。この唯一の紙ケースをタイプ１と名付け、従来の関係を満たしていることが判明した。

タイプ 1 は、紙の裏側に抵抗力が作用しないため、他の考えられるケースよりも優れています。続いて、裏面にプラスチック支持体を備えた紙をタイプ 2 と名付け、裏面にチャネルカットを備えたプラスチック支持体を備えた紙をタイプ 3 と名付けたさらに 2 つのケースを調べました。 3 つのケースすべての概略図を図に示します。 .8a。 3 つの例のそれぞれで、多くの液体流動テストが実行されます。実験の結果は図 8b で比較されています。タイプ 1 とタイプ 3 の流速はほぼ同じですが、タイプ 2 は抵抗が大きいため流速がわずかに遅いことがわかりました。その結果、プラスチック層による強度があり、カットによる抵抗力の減少によりタイプ 1 と同等の流速を持つタイプ 3 を最良のシナリオとして選択しました。

支持層の概略図をここに示します。(a) タイプ 1、タイプ 2、タイプ 3 の 3 つのケースについて。(b) 3 つの異なるケースすべてにおける液体の移動距離の実験の比較。

統計分析の概略図をここに示します。 (a) ガウス分布曲線の下の $\pm \sigma$ の範囲がここに示されています。 (b) 色強度値の正規分布傾向を検証するために、特定の一連の実験の Q-Q プロットをここに示します。

詳細な誤差分析が実行され、表 3 にリストされます。ここでは、体積、重量、長さ、色の強度を測定するための機器と系統誤差を示しました。体積は測定ジャーとピペットによって測定されますが、これらには機器の不確実性があります。重量は秤量天秤によって測定されますが、これにも計測の不確かさがあります。レーザーカッターを使用して長さを測定する際の計測の不確かさを考慮しました。実験を繰り返す場合、色の強度の測定には系統的な不確実性が考慮されます。すべてのデータ点から最大誤差バーを持つ点を選択し、その点の不確実性の割合を求めました。

さらに、すべての異物の検出ゾーンの色の強度が統計的に分析されます。すべての色強度データは正規分布傾向を示します。繰り返された実験から色の強度の平均値を取得するために、ガウス分布曲線の $67\%$ 領域下のデータを考慮しました。ガウス曲線の概略図を図 9a に示します。また、分位数-分位数 (Q-Q) プロット分析を実行して、ガウス傾向を確認しました。炭酸水素ナトリウムのQ-Qプロットを図9bに示しますが、尾部は直線と一致していません。色の強度のガウス分布は右に歪んでいる、左に歪んでいるが、本体はガウス分布に一致していることが分かりました。すべての異なる濃度に対するいくつかの混入物の散在データプロットを図S7に示します。すべてのデータポイントに対してベイズ回帰分析も実行しました。いくつかの混和物に対するベイジアン回帰分析の詳細な説明は、補足文書 S1 に記載されています。混入物のベイジアン回帰表を表 S6 に示します。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開された論文 [およびその補足情報ファイル] に含まれています。現在の研究中に使用および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手することもできます。

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この研究は、インド政府教育省の著名な機関制度への資金提供の下、インド工科大学マドラス校からマイクロ・ナノ・バイオ流体工学グループへの支援を受けています[Sanction. いいえ: $11/9/2019-U.3(A)$]。 SP は、データ分析中のシッダント・モハパトラ氏の協力に感謝します。 PSMは、インドにおける牛乳の異物混入問題の深刻さを理解するために、プジャ・ドゥデジャ博士およびスバルナ・シンハ・マハパトラ博士との有益な議論に感謝します。

マイクロ・ナノ・バイオ流体グループ、機械工学部、インド工科大学マドラス校、チェンナイ、600036、インド

スバシス・パタリ、プリヤンカン・ダッタ、パララブ・シンハ・マハパトラ

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SP は実験を計画し、パフォーマンスを特徴付け、データを分析しました。 PSM がこの研究を監督しました。著者全員が原稿を執筆、レビューし、結果について議論しました。

パラブ・シンハ・マハパトラへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

補足２．

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転載と許可

Patari, S.、Datta, P.、Mahapatra, PS 3D 紙ベースの牛乳の異物混入検出装置。 Sci Rep 12、13657 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-17851-3

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受信日: 2022 年 4 月 28 日

受理日: 2022 年 8 月 2 日

公開日: 2022 年 8 月 11 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-17851-3

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