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Nature Microbiology volume 7、pages 2068–2077 (2022)この記事を引用

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メトリクスの詳細

海洋植物プランクトンは地球上の光合成の約半分を担っています。多くは光合成と有機炭素の従属栄養同化を組み合わせた混合栄養生物であるが、これら 2 つの生活様式の相対的な寄与は不明である。今回の単細胞測定により、東地中海の光帯の底にあるプロクロロコッカスは、成長に必要な炭素の約 20% しか光合成によって得ていないことが明らかになりました。これは、光生理学パラメータに基づいて実験室で校正された計算と、現場での増殖速度との比較によって裏付けられています。エージェントベースのシミュレーションでは、混合栄養細胞は偏性光独立栄養細胞よりも数十メートル深く成長し、栄養塩層を約20メートル深くする可能性があることが示されています。北大西洋と北太平洋の時系列は、熱成層中に、プロクロロコッカス細胞の平均 8 ～ 10% が、絶対的な光独立栄養集団を維持するのに十分な光がなくても生きていることを示しています。これらの結果を総合すると、混合栄養性が世界のプロクロロコッカス個体群の大部分とその集団的な遺伝的多様性の生態学的成功を支えていることを示唆しています。

植物プランクトンによる光合成は、海洋食物網と炭素貯留層を支えるエネルギーと固定炭素の大部分を提供します1。しかし、厳密に光独立栄養性である植物プランクトンはほとんどありません2。多くの植物プランクトンはまた、溶解有機物を利用し、粒子状の砕屑性有機物を取り込んだり、他の生きた細胞を捕食したり、細胞小器官を収穫したりすることもあります2。細胞が炭素を固定し、外因的に利用可能な有機炭素を利用する混合栄養ライフスタイル（以下、浸透圧）は、例えば、無機資源の相対的な利用可能性が生理的要求と異なる場合（例えば、光強度は低いが、無機栄養素は十分に存在する）、適応度を高める可能性がある。豊富）3．ミクソトロフィーはエネルギーを節約し、競合他社が利用できるリソースを削減する可能性もあります2。植物プランクトンの生活史に対する混合栄養性の潜在的な重要性にもかかわらず、植物プランクトンの成長に対する従属栄養性炭素同化の寄与は十分に定量化されていません4。シミュレーションでは、混合栄養性が植物プランクトンにとって世界的に重要な炭素源である可能性があることが示唆されています5が、この予測を経験的データで定量的に検証することは現時点では困難です。その理由の 1 つは、海洋中の溶存有機炭素 (DOC) が非常に複雑な化合物の混合物を構成しており、そのほとんどが特徴づけられていないことです。これは、特定の有機炭素源（グルコースやアミノ酸など）8,9 を使用した取り込み測定は、利用可能な DOC プール全体を表しておらず、実際の DOC 取り込み速度、したがって主要な植物プランクトン種の混合栄養性を過小評価している可能性があることを意味します10。

プロクロロコッカスは地球上で最も豊富な光合成細胞であり、海面から光帯の底部（約160メートル）までの深さで活発に増殖している（参考文献11）。これらの深さでは、光合成利用可能放射線 (PAR) が 3 ～ 4 桁変化しており、多様なプロクロロコッカス系統が光合成装置のさまざまな適応を利用して直面している課題です 11,12。これらの適応により、プロクロロコッカスは高光 (HL) 適応クレードと低光 (LL) 適応クレードに多様化しました 11,12。さらに、プロクロロコッカスは混合栄養生物であり、グルコース8、ピルビン酸13、アミノ酸9、ヌクレオチド10、そしておそらくはジメチルスルホニオプロピオネート14、15などの溶解した有機化合物を取り込むことができます。しかし、この世界的に豊富な系統において、DOCの摂取が呼吸および/または成長のために光合成によって固定された炭素をどの程度補充または置き換えることができるかはまだ不明である10。利用可能な証拠は、混合栄養性がプロクロロコッカスが限られた暗闇の中で生き残るのに役立つ一方で、無菌細胞は光にさらされないと約1週間後に死ぬことを示唆しており 13,16 、これは集光とおそらく光合成がおそらく必須であることを示している。

この記事では、海洋におけるプロクロロコッカスに対する従属栄養性炭素同化の寄与を評価するために多面的なアプローチを採用します。まず、同位体測定を使用して、地中海の光帯の底部にある野生のプロクロロコッカス個体群における光合成と窒素の取り込みを定量化します。次に、太平洋で観察された成長速度と、実験室で校正された光生理学的モデルによってシミュレートされた純粋な光独立栄養成長速度とを比較します。また、個人ベースのモデルを使用して、混合栄養がどのようにフィットネス上の利点を提供し、栄養ラインを強化するかを説明します。最後に、亜熱帯循環におけるプロクロロコッカス生態型の垂直プロファイルの時系列観察を使用して、いくつかのクレードが混合栄養性炭素同化に大きく依存していることを示します。全体として、これらの結果は、プロクロロコッカスによる深さ統合炭素同化の最大 4 分の 1 が DOC に由来しており、地球規模の C サイクルに影響を及ぼしていること、およびプロクロロコッカスの多様性のかなりの部分を支えるには混合栄養性が不可欠であることを示唆しています。

光が制限されている可能性がある光帯の基部からの天然のプロクロロコッカス集団における光合成と従属栄養性炭素取り込みの相対的な寄与を評価するために、超貧栄養東部地域で夏の終わりにプロクロロコッカス集団の構造と細胞ごとの活動を評価します。地中海17．サンプリング時点では、水柱は高度に層状化しており、栄養分は約140 mまで枯渇しており、深さ約115 mで顕著な深部クロロフィル最大値（DCM）が観察されました（図1a）。プロクロロコッカスは、地表下で数的に優勢な植物プランクトンであり（図1b）、細胞ごとの蛍光に基づいて2つの集団に分けることができました。地表から115 mまでの低蛍光集団と、から115 mまでの高蛍光集団です。 115 m ～ 150 m、115 m でオーバーラップします (図 1c、d)。プロクロロコッカスにおける細胞ごとのクロロフィル蛍光の深さによる変化は一般的に観察されており 18,19,20 、通常、HL 適応細胞 (低蛍光) から LL 適応細胞 (高蛍光）のもの19．しかし、表現型の不均一性 (順化) もこの現象に寄与する可能性があり 21、実際、16S 遺伝子と 23S 遺伝子の間の内部転写スペーサー (ITS) のアンプリコン配列決定により 21,22、DCM の周囲で HL クレードから LL クレードへの緩やかな移行が明らかになり、両方のことが示唆されています。深さによる遺伝子型と表現型の変化（図1c）。フローサイトメトリーと遺伝的データは両方とも以前の研究と一致しており 21,23 、サンプリング前の少なくとも 3 ～ 4 日間は水柱が比較的安定していたことを示唆しています 20。特に、DCMでの光強度（午後の深さ115〜125 mで〜3〜5μmol光子m−2 s−1、図1a）は、実験室条件下では一部のLL株の増殖をサポートするのに潜在的に十分ですが、ほとんどのHL株の活発な増殖には不十分です24。 HL 細胞は、115 メートルではプロクロロコッカス集団の 50% 以上を占め、125 メートルでは約 25% を占めるため、これらのサンプル中のプロクロロコッカス細胞のかなりの部分が、実験室培養物が純粋に独立栄養的に増殖できない条件下で生きていることを示唆しています (図 1)。 1c)。

a、PAR、NO2 + NO3、およびクロロフィル (Chl) の深さプロファイル。 b、フローサイトメトリーを使用した植物プランクトン細胞数。 c、ITSシーケンスによって決定された、水柱全体にわたるさまざまなプロクロロコッカスクレードの相対存在量（HLIは高光に適応したクレードIを示し、HLIIは高光に適応したクレードIIを示し、LLIは低光に適応したクレードIを示し、LLII/ III は低光適応クレード II および III を示し、LLIV は低光適応クレード IV を示し、LLVII は低光適応クレード VII を示し、Syn はシネココッカスを示します。 d、プロクロロコッカスの細胞あたりのクロロフィル蛍光（FL）の密度プロット。 65 m と 100 m の間で集団構造 (c) の付随的な変化がないクロロフィル蛍光の変化 (d) に注目してください。 115 mを超えるとLLクレードが存在し(c)、115 mでのみ二重集団が観察される(d)のに対し、HLクレードが存在することにも注目してください。 d の円は、NanoSIMS によって分類および分析された集団を表し、e と同様に色分けされています。 e、115メートルからの各分類された部分集団、125メートルからの単一集団、および実験室培養物のNanoSIMS分析からのC特異的C取り込み速度（μC）対N特異的N取り込み速度（μN）の比の密度プロット。各集団で測定された細胞の数は、45 (LL 115 m)、49 (HL 115 m)、55 (125 m)、および 489 (実験室培養) です。これらの分析に使用された散布図とゲートを拡張データ図 1 に示します。

ソースデータ

次に、ナノスケール二次イオン質量分析法 (NanoSIMS) を使用して、DCM からの単一のプロクロロコッカス細胞における 13C 標識重炭酸塩 (光合成による 13C 固定を表す) と 15N 標識アンモニウム (窒素の取り込みを表す) の取り込みを測定しました。基本的に、深さ 115 および 125 m のプロクロロコッカス細胞はすべて活動していました (光合成し、NH4 を取り込みました)。自然サンプル中の基本的にすべてのプロクロロコッカス細胞が活性であるという観察は、北太平洋での同様の研究と一致しており 25、実験室培養で観察される死んだ細胞または退色細胞は、少なくとも中期には自然界では比較的まれである可能性があることを示唆しています 25。 DCMでの一日。それにもかかわらず、たとえ光強度が最大のときに取り込み実験が行われたとしても、これらの深さでの細胞あたりの光合成速度は、窒素固有の窒素取り込み速度によって示される成長速度をサポートするには十分ではありませんでした（図1e）。細胞周期分析とジビニルクロロフィルへの 14C の取り込みに基づく複数の海洋地域での以前の研究では、深さ 100 ～ 150 m のプロクロロコッカス細胞は 4 ～ 7 日ごとに複製する (増殖速度は 0.14 ～ 0.25 日 -1) ことが示されています (参考文献)。 .27,28,29,30）。しかし、観察された C 特異的な C 取り込み速度 (μC) はわずか約 0.024 日 -1 であり、これらの予想される増殖速度をサポートするには低すぎます。一方、観察された N 特異的な N 取り込み速度 (μN) は約 0.16 日 -1 でした。倍増時間は約 6 日です。さらに、フィールドではμC/μN はわずか約 0.15 であり、約 1 (μC ≈ μN) であると予想される通常の細胞よりもはるかに低かった。実際、実験室で培養されたプロクロロコッカスのμC / μNは〜0.75であり（図1e）、北太平洋の亜熱帯循環およびカリフォルニア海流システムの表面サンプルでは〜1でした。総合すると、これらの定量的観察は、DCM でのこれらのプロクロロコッカス細胞の予想される増殖速度に必要な C の >80% が非光合成源に由来する必要があることを示唆しています。

私たちの地中海のサンプルは、光帯の深部でプロクロロコッカスによって同化された炭素の大部分が有機起源であることを示唆しています。この解釈は、炭素特異的な光合成炭素固定速度（1 日目）を評価し、それを細胞周期分析に基づいて現場で観察された成長速度（1 日目）と比較することでテストできます 31,32。光合成速度が観察された成長速度よりも小さい場合、その差は従属栄養的に支援された成長であると解釈します。深さの関数として炭素固有の光合成速度 (day-1) を評価するために、観測された光子束によって駆動される、実験室で校正されたパラメーター値を使用した光合成と放射照度の関係 33 (式 (4) および方法) の標準表現を採用しました。密度。クロロフィル:C 比は測定されていないため、最大成長速度も評価し、一定の維持呼吸数を仮定する高分子配分の実験室で校正されたモデル 34 を使用して、光強度と成長速度の関数として評価されました (詳細については、「方法」を参照) ）。したがって、方程式 (5) を使用して、潜在的な独立栄養増殖速度を評価しました。各深度で可能な光合成速度の範囲をまとめるために、Moore と Chisholm24 から得た、それぞれ HL と LL の両方で順応した HL および LL 生態型の光合成 - 放射照度パラメーターを使用しました。上部の光ゾーンでは、光ではなく栄養素が制限されます。したがって、観察された環境濃度によって決まる固定窒素、リン酸塩、および溶存鉄の摂取率のアロメトリックスケーリングを使用して、栄養素固有の栄養素摂取率（1日）を深さの関数として評価しました35,36。我々は、特定の炭素または栄養素の取り込み速度の最小値が各深さでの独立栄養成長速度を制御すると仮定しました。私たちは、適切なデータセットが利用可能な太平洋の 2 つのサイトで、プロクロロコッカスの推定独立栄養速度と観察された増殖速度の垂直プロファイルを比較しました。プロクロロコッカスの細胞周期に基づく増殖速度を観察するには、高い時間分解能での集中的なサンプリングが必要ですが、地中海からは入手できません。したがって、我々は、赤道太平洋 (EqPac、北緯 0 度、西経 140 度) および北太平洋の亜熱帯環流 (ハワイ海洋時系列) における Vaulot ら 31 および Liu ら 32 からの細胞周期に基づく成長速度データを使用しました。 (HOT)、北緯 22 度 45 分、西経 158 度、ステーションアロハ)。同時に発生する光子束と栄養塩濃度は、それぞれ大規模な生物地球化学調査 (JGOFS EqPac)37 と時系列ステーション (HOT)38 から入手できました (図 2a、c、補足テキストおよび拡張データ図 2)。

a、c、HOT での PAR と溶存無機窒素 (DIN) の観察 (1994 年 7 月、a)、および EqPac での PAR と溶存鉄 (Fe) の観察 (1992 年 4 月、c)。 b、d、シミュレーションされた独立栄養増殖速度（青とオレンジの破線）および観察された増殖速度（細胞周期分析から得られた点のある赤い実線、赤い四角は線形補間されたデータポイント、Liu et al.32およびVaulotからのデータ） et al.31) HOT (b) および EqPac (d)。青とマゼンタの破線は、それぞれ光阻害あり/なしの HL および LL 光合成パラメーター化を使用してシミュレートされた独立栄養成長速度を表します (詳細については、「方法」を参照)。青い陰影は、上記の 4 つのシナリオでシミュレーションされた独立栄養増殖速度の極端な範囲を表しています。赤い陰影は、シミュレーションされた独立栄養成長速度と観察された成長速度の差として推定される従属栄養成長速度を表します。測定された成長速度には独立栄養成長と従属栄養成長の両方が含まれており、少なくとも 150 m の深さで成長が観察された同じ研究からの他の深さプロファイルを代表しています。エラーバーは、Vaulot et al.31 に従って、HOT および EqPac で観察された増殖速度の 19% 誤差 (n = 11 の生物学的に独立したサンプル) を表します。 c に示す 120 m 以上の Fe 濃度は 0.03 nmol l−1 未満（検出限界以下 37）と報告されていますが、計算には 0.03 nmol l−1 を使用します。

ソースデータ

推定された純粋に独立栄養的な成長速度は、各深さで最も制限された資源によって決定されました（図2b、d）。光と炭素の固定は、光層のより深い領域でのシミュレーションによる独立栄養成長を強く制限しましたが、光阻害による固定窒素（HOT）、鉄（EqPac）、および炭素の固定は、表面近くで重要でした（図2）。。表面で観察された成長速度は、HLおよびLL株の光生理学的パラメーターから予測された範囲内にほとんどありましたが（図2b、dの青い陰影）、モデルは観察された成長速度が約75〜100未満であることを解決できませんでした。両駅ともにメートル。むしろ、このモデルは、光合成だけでは深さで観察された分裂速度を説明できないことを明白に示唆している。プロクロロコッカスの有機炭素同化の最小速度を推測するために、モデル化された独立栄養速度と深さで観察された実際の成長速度 (赤い陰影) の間の差異を解釈します。太平洋の 2 つの観測点は、非常に異なる物理的および生物地球化学的状況を表していますが、同様の質的構造を示しています。ミクソトロフィーは、2 つの観測点の異なる深さ (HOT で 95 m、EqPac で 60 m) では重要になるようですが、PAR のレベルは同様 (~15 μmol 光子 m-2 s-1、表面 PAR の ~5%) です。観察された細胞密度 31,32 と想定される細胞炭素割り当て量 39 を使用して、プロクロロコッカスの垂直統合独立栄養性正味一次生産量は、HOT では約 0.35 g C m-2 day-1、EqPac では約 0.20 g C m-2 day-1 であると推定されました。、垂直統合された従属栄養寄与（図2b、dの赤い陰影に基づく）は、HOTで〜0.075 g C m-2 day-1、EqPacで〜0.069 g C m-2 day-1です。言い換えれば、有機炭素の同化は、HOT では総プロクロロコッカスバイオマス生産の約 18%、EqPac では約 25% をサポートすると推測されます。さらに、有機炭素の取り込みは、混合栄養性の寄与が光合成よりも大きい深度以下の総生産量の、HOT で約 80%、EqPac で 54% に寄与しており、これは地中海の深光帯からの同位体推論とほぼ一致しています。このモデルはプロクロロコッカスによる有機炭素の浸出を考慮していないことに注意してください。これは実験的に十分に制限されておらず、おそらく表面での推定成長速度を低下させる可能性があります40、41、42、43。実際、混合栄養性（グルコースとアミノ酸の取り込み）が表面プロクロロコッカスで観察されており9,10、我々の推定が統合されたプロクロロコッカスの生産に対する混合栄養性の寄与の下限を提供していることを示唆している。

生物地球化学的動態における混合栄養性の影響を調査するために、我々は、個体ベースのモデリングアプローチ (詳細については「方法」を参照) を採用し、光と栄養の 2 つの環境における個々のプロクロロコッカス細胞 (または多くの細胞を表すスーパーエージェント) の軌跡をシミュレートしました。次元の高解像度の乱流流体の流れ (補足ビデオ 1 を参照)。無機栄養素と DOC のようなトレーサーは、密度ベースの方程式で表されます。簡単に言うと、個体は光合成によって炭素を固定し、無機窒素とリンを取り込みます。 2 つの理想的なタイプの個人が別々にシミュレートされます。1 つは厳格な光独立栄養性のライフスタイルを持ち、もう 1 つは混合栄養性で DOC 様物質から炭素を同化することができます。 Coe et al.13 が示唆しているように、混合栄養性の個体は厳密に従属栄養的に生きることはできず、取り込まれる C の少なくとも 1% が光合成によるものであることをパラメータ化しています (拡張データ図 3)。図3aでは、純粋な独立栄養性と混合栄養性のシミュレーションからの細胞密度の水平平均プロファイルを示し、混合栄養性が約75μm以下のプロクロロコッカスの集団をどのようにサポートしているかを示しています。深さでの〜0.2日-1というシミュレートされた日次分裂速度（図3b）は、亜熱帯および赤道太平洋の公表された細胞周期プロファイルと一致しており、前述の地中海での推定分裂速度よりもわずかに高いです31,32。それはNH4の取り込みに基づいています。混合栄養生物と独立栄養生物は、混合層 (表層 50 m) で同じ分裂速度 (~0.3 day-1) を共有しており、無機栄養素がシミュレーションの制限要因となっています。その後、独立栄養生物は深さ 60 m で最大 1 日分裂速度 ~0.5 day-1 に達し、そこで N から C への移行が起こり、その後、光の制限により深さ 90 m で急速にゼロに減少します。対照的に、混合栄養株は、NからCへの制限の移行が起こる深さ80 mで〜0.5 day-1のより深い最大成長速度を持ち、深さ125 mでは〜0.2 day-1まで徐々に減少します（図3b）。混合栄養株のより深い最大分裂深度と、光合成が十分ではない深さで個体群を維持する能力は、図3bに黒い線で示されているDOC利用によって裏付けられています。混合栄養シミュレーションでは、垂直統合された総生産量に対するDOC取り込みの寄与は〜12％であり、図3bの赤い縞の下で光が制限要因になる場合は〜43％です。 DOC の寄与とプロクロロコッカスが増殖できる最大深さは、分裂速度プロファイルモデルとほぼ一致しており、DOC 様物質の栄養価を制御するパラメーター値に敏感です (経験データによって事前に制限することはできません)。この時点では; メソッド)。特に、図3bの横縞は、2つのシミュレーションのアンサンブルにおいて制限が栄養素からCに移行した深さを示しています。シミュレートされた混合栄養細胞は、純粋な独立栄養細胞よりも深く成長し、無機栄養素を吸収し、顕著に深い栄養系統をもたらします（図3c）。

すべてのパネルの赤と青の誤差帯は、10 回のモデル実行のアンサンブルの最小値と最大値を示します。 a、模擬独立栄養細胞（青）と混合栄養細胞（赤）の細胞密度の垂直プロファイル。 PAR の垂直プロファイルは灰色の破線で表されます。 b、独立栄養生物（青）と混合栄養生物（赤）の細胞分裂速度の垂直プロファイル。青と赤の縞は、植物プランクトンの成長の栄養制限から炭素制限への移行点を示します。黒い点線は、混合栄養生物における総炭素獲得に対する DOC 取り込みの寄与を表しています。 c、独立栄養生物（青）と混合栄養生物（赤）のシミュレーションにおけるリン酸塩の垂直プロファイル。

ソースデータ

混合栄養性は、遺伝的に多様な天然のプロクロロコッカス集団内のさまざまな系統をどの程度サポートしているのでしょうか? この疑問に答えるために、我々は、北太平洋と北大西洋の環流（ハワイ時間とバミューダ時間）における、光合成だけでサポートできる深度以下に生息するプロクロロコッカス細胞と個々の生態型の割合を、5年間の時系列にわたって計算した。 -シリーズの研究サイト、それぞれ23;詳細については、補足情報を参照してください。ここでは、水柱が層状になる時期（図 4 の白い領域）のみを考慮します。これは、光の深さよりも浅い混合層の深さ（光の強度が >10 μmol 光子 m−2 s−1 である）として定義されます。 HL 株の場合は >2.8 μmol 光子 m-2 s-1、LL 株の場合は 14 時間:10 時間の昼夜サイクル中の HL および LL 適応株の活発な増殖に必要な最小光量を実験的に決定しました 24)。これは、他の場合には、光深度より下であっても上部混合層内にある細胞が表面近くに移動し、その結果、より多くの光を受け取る可能性があるためである。これらの層別期間中のプロクロロコッカス細胞の平均〜8〜10％が光不足になる可能性があります（最大30％、図4a、b）。これには、LL に適応したエコタイプに属する細胞の大部分が含まれます (定量的 PCR23 を使用して測定)。 LL 適応細胞は、混合栄養性 (糖やアミノ酸の取り込みなど 10,44) に潜在的に関与する可能性のあるより多くの遺伝子をコードしており、プロクロロコッカスの「集合体」の遺伝的多様性のかなりの部分を占めています。私たちは、これらの細胞のほとんどは、深光帯ニッチで生き残るために混合栄養性を必要とすることを提案します（図4c、d）。

a、b、ハワイ (a) とバミューダ (b) の光ゾーンの下で見つかったプロクロロコッカス細胞 (Pro) の合計の割合。実験室培養における代表的な菌株の増殖をサポートする統合照明レベルとして定義されます 24 (灰色の線はこの深さを示します) HL株の場合）。黒い線は混合層深さ (MLD) を示し、灰色の線は光深度 (PD) を示し、緑色の点は光深度以下のプロクロロコッカスの割合 (フローサイトメトリーによってカウント) を表し、灰色の領域は非層別層を表します。細胞が深部から表面まで混合する可能性がある条件。 c、d、定量的PCRによって測定された、光深度未満の各プロクロロコッカス生態型の割合。データは Malmstrom et al.23 から取得したものです。詳細については、補足情報を参照してください。

ソースデータ

我々は、プロクロロコッカスによる混合栄養性炭素同化の重要性を示すいくつかの証拠を提示した。地中海からのサンプル中の同位体標識窒素の取り込みは、DCM で約 1 週間の倍加時間を示しており、赤道および亜熱帯太平洋での細胞周期に基づく観察と一致しています 27,29,30,31,32。関連する標識炭素の取り込みは、同化された炭素の 4 分の 3 以上が有機物由来である場合にのみ、この成長速度が実現可能であることを示唆しています。炭素固有の光合成速度と地域の環境データの実験室で校正されたモデルを使用して、炭素制限成長速度と太平洋の場所で観察された細胞周期の観察を比較しました。私たちは、プロクロロコッカスによる深度統合された正味炭素同化の 18 ～ 25% がこれらのサイトで従属栄養的であり、DCM では 80% もの従属栄養的炭素供給があると推定しました。これにより、プロクロロコッカスが光独立栄養性の一次生産者であるという認識が変わりました。リモートセンシングに基づく地球規模の一次生産量の推定などの製品は、通常、同位体標識された無機炭素の研究からのデータで校正されており、したがって他の誤差源にもかかわらず、適切に推定されているため、我々は、これらの製品が強い影響を受けるとは予想していない。成長速度ではなく光合成です。私たちは、DOC のような物質を解決する個人ベースのモデルを使用したシミュレーションで、この現象がもたらす広範な影響を調査しました。これらのシミュレーションは、より深い光層におけるそのような広範な混合栄養性が栄養塩系統を顕著に深くすることを示唆している。これは炭素循環シミュレーションにとって重要ですが、そのほとんどは現在混合栄養性を解決しておらず、浅すぎる栄養塩系を予測したり、不適切に調整したりする可能性があります。このことは、「リサイクル業者」と「独立栄養生物」も資源をめぐって競合し、生態系の動態に影響を与える可能性があることを思い出させます45。最後に、亜熱帯の北太平洋と北大西洋における生態型の鉛直生物地理学を調べたところ、LL に適応したプロクロロコッカスは、季節に応じて、光独立栄養的に生存可能な個体群を維持するために、その時間の 50 ～ 100% を最も深い地平線の下で過ごしていることが示されています。私たちは、光合成ではなく混合栄養への依存が、世界のプロクロロコッカス個体群の大部分とその集団的な遺伝的多様性の生態学的成功を支えていると提案します。

地中海の海水は、2017 年 8 月に 11 の深さ (ステーション N1200、北緯 32.45 度、東経 34.37 度) からニスキンボトルで収集され、3 つの 250 ml ポリカーボネートボトルに分割されました。各深度からの 2 本のボトルを 1 mM 重炭酸ナトリウム-13C および 1 mM 塩化アンモニウム-15N (Sigma-Aldrich) でラベルし、3 つのボトルすべて (2 つはラベル付き、1 つは対照) を元の深度と海上ステーションで 3.5 分間インキュベートしました。正午頃。安定同位体は、単一細胞における C および N の取り込みを直接比較できるように選択され、同位体希釈と、コミュニティメンバー間での 13C および 15N の再利用および移動の可能性を最小限に抑えるために、短いインキュベーション時間が選択されました 25。インキュベーション後、ボトルを船上に戻し、2×電子顕微鏡グレードのグルタルアルデヒド（最終濃度2.5％）で固定することによりインキュベーションを停止し、選別分析まで4℃で保管した。細胞選別、NanoSIMS 分析、および取り込み率の計算は、Roth-Rosenberg et al.26 に記載されているように実行されました。

DNA のサンプルは 0.22 μm Sterivex フィルター (Millipore) 上で収集されました。注射器を使用して過剰な水を除去し、1 mlの溶解緩衝液(40 mM EDTA、50 mM Tris pH 8.3、および0.75 M スクロース)を加え、フィルターの両端をパラフィルムで閉じた。抽出するまでサンプルは -80 °C で保存されました。 DNA は、QIAamp DNA ミニプロトコルを使用した自動化ステップの前に、手動化学細胞溶解を含む半自動プロトコルを使用して抽出されました。血液または体液からの DNA 精製 (スピンプロトコル、ステップ 6 から開始、医学部、BioRap ユニット)テクニオン）。手動プロトコルはサンプルを解凍することから始まり、次にシリンジを使用して保存バッファーを除去し、170 μl の溶解バッファーをフィルターに追加しました。 30 マイクロリットルのリゾチーム (20 mg ml-1) をフィルターに添加し、37 °C で 30 分間インキュベートしました。インキュベーション後、20 μl プロテイナーゼ K および 200 μl バッファー AL (Qiagen キットより) をチューブに 56 °C で 1 時間 (撹拌しながら) 加えました。上清を新しいチューブに移し、QIAcube 自動システムを使用して DNA を抽出しました。すべての DNA サンプルを 100 μl の DNA を含まない蒸留水で溶出しました。

ITS の PCR 増幅は、Prochromococcus CS1_16S_1247F (5'-ACACTGACGACATGGTTCTACACGTACTACAATGCTACGG) および Cs2_ITS_Ar (5'-TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTGGACCTCACCCTTATCAGGG) に特異的なプライマーを使用して実行されました 21,22。最初のＰＣＲは、０．５ｎｇの鋳型、１２．５μｌのＭｙＴａｑＲｅｄＭｉｘ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）および０．５μｌの１０μＭの各プライマーを含む総量２５μｌ中で３回行った。増幅条件は、95 °C で 5 分間のステップ、95 °C で 30 秒間、50 °C で 30 秒間および 72 °C で 1 分間の 28/25 (16 S/ITS) サイクルと、それに続く 5 つのステップで構成されました。 72℃で最低。すべての PCR 産物は 1% アガロースゲルで検証され、3 つずつプールされました。続いて、2回目のPCR増幅を行ってライブラリーを調製した。これらをプールし、品質管理の後、Illumina MiSeq シーケンサーを使用してシーケンス (2 × 250 ペアエンドリード) を行いました。ライブラリーの準備とプールは、イリノイ大学シカゴ校の DNA サービス施設で行われました。 MiSeq シーケンスは、イリノイ大学アーバナシャンペーン校の比較機能ゲノミクス WM Keck センターで実施されました。

ペアエンドリードは Dada2 パイプライン 46 を使用して分析されました。サンプルごとのシーケンスの品質は、Dada2 の「plotQualityProfile」コマンドを使用して検査されました。品質フィルタリングは、品質フィルタリングのパラメータ truncLen=c(290,260)、maxN=0、maxEE=c(2,2)、truncQ=2、rm.phix=TRUE、trimLeft=c() を指定した Dada2 'filterAndTrim' コマンドを使用して実行されました。 20,20)。エラー推定と複製解除に続いて、Dada2 アルゴリズムを使用してシーケンスを修正しました。順方向リードと逆方向リードのマージは、4 bp の最小オーバーラップで行われました。疑わしいキメラの検出と削除は、「removeBimeraDenovo」コマンドを使用して行われました。合計で、484 個のアンプリコン配列バリアントの 388,417 個の配列がカウントされました。アンプリコン配列変異体は MEGA6 でアラインメントされ (参考文献 47)、16S 遺伝子に対応する最初の約 295 ヌクレオチドがトリミングされました。次に、培養されたプロクロロコッカス株およびシネココッカス株、ならびに未培養の HL および LL クレードからの ITS 配列のカスタムデータベースに対して、BLASTn を使用して ITS 配列を分類しました。

PlanktonIndividuals.jl (v0.1.9) は、個人ベースのシミュレーションを実行するために使用されました48。簡単に説明すると、細胞は光合成を通じて無機炭素を固定し、水柱からの窒素、リン、DOCを細胞内割り当て量に固定し、分裂または放牧まで成長します。細胞分裂は、細胞サイズの確率関数としてモデル化されます。放牧は細胞集団の二次確率関数で表されます。細胞は、オイラーの密度ベースのトレーサーとして表される栄養リソースを消費します。状態変数とモデル方程式の完全なドキュメントは、https://juliaocean.github.io/PlanktonIndividuals.jl/dev/ でオンラインで入手できます。混合栄養症に関連する方程式は、オンラインドキュメントへの追加として以下に示されています。

ここで、VDOC は細胞固有の DOC 取り込み速度 (mol C cell−1 s−1)、\(V_{{\mathrm{DOC}}}^{{\mathrm{max}}}\) は細胞の最大値です。比 DOC 取り込み速度 (mol C cell−1 s−1)、\(q_{\mathrm{C}}^{{\mathrm{max}}}\) は最大細胞炭素割り当て (mol C cell−1) , \(q_{\mathrm{C}}^{{\mathrm{min}}}\) は、最小セル炭素割り当て (mol C cell−1) です。ここでの最大関数と最小関数は、qC を \(q_{\mathrm{C}}^{{\mathrm{min}}}\) と \(q_{\mathrm{C}}^{{\mathrm) の間に保つために使用されます。 {最大}}}\)。 \(K_{{\mathrm{DOC}}}^{{\mathrm{sat}}}\) は、DOC 取り込みの半飽和定数 (mol C m−3) です。 fPS は、光合成に由来する固定 C の割合 (PS、mol C cell-1 s-1) です。研究室によると、fPS が \(f_{{\mathrm{PS}}}^{{\mathrm{min}}}\) (光合成由来の固定 C の最小割合、デフォルトで 1%) より小さい場合、DOC の取り込みは停止します。プロクロロコッカスに関する研究では、たとえ有機炭素源が供給されたとしても、暗闇に長時間（数日を超えて）さらされても生き残ることができないことが示されました13。 (1 − fPS) も DOC 取り込みの寄与として図 3 に示されています。

2 つの別々のシミュレーションを設定しました。それらのそれぞれには、偏性光独立栄養生物またはDOCも消費する混合栄養生物のいずれかの集団が存在します。初期条件とパラメーター (補足表 3) は、混合栄養性の能力を除いて 2 つのシミュレーションで同じです。シミュレーションは、定常状態を達成するために、1 分のタイムステップで 360 日間シミュレーション実行されました。確率過程の範囲を取得するために、2 つのシミュレーションを複数回実行します。

Platt et al.33 に従って、炭素固有の日平均炭素固定率 ℙ を光強度 (I、μE) の関数として評価しました。

ここで、\(P_{\mathrm{S}}^{{\mathrm{Chl}}}\)、αChl、βChl は、クロロフィル a 固有の炭素固定率 (mol C (mol Chl)- 1 s−1)、それぞれ光合成と光の関係の初期傾き、および高光子束における光阻害効果。 \(P_{\mathrm{S}}^{{\mathrm{Chl}}}\)、αChl、βChl には、Moore と Chisholm の発表された研究から経験的に決定された値を課します24。自然のプロクロロコッカス群集は、\(P_{\mathrm{S}}^{{\mathrm{Chl}}}\)、αChl、βChl の異なる値を持つ HL および LL エコタイプで構成されており、群集の成長率は次のように予想されます。 HL 極値と LL 極値の間であること。したがって、70 μmol 光子 m-2 s-1 に順応した HL 適応生態型 (MIT9215) と 9 μmol 光子 m-2 s-1 に順応した LL 適応生態型 (MIT9211) の光生理学的パラメーターを使用します。これらの値を持つモデルは、図 2b、d の異なる線として示されています。 I は時間ごとの PAR であり、各深度で観測された正午の値を、地理的位置と年の時刻に基づく天文公式から評価された日内変動でスケールすることによって推定されます 37,38。

\(\frac{{q_{{\mathrm{Chl}}}}}{{q_{\mathrm{C}}}}\) はクロロフィル A と炭素のモル比であり、成長の関数としてモデル化されます。 Inomura34 モデル (式 17) を使用した速度と光の強度。パラメータは Healey49 からの実験室データで校正されました。さらに、高分子の割り当てに基づく最大成長率 (\(\mu _{{\mathrm{max}}}^I\)) も、猪村モデル (式 30) を使用して推定されます。成長速度の初期推定と経験的に得られた光の強度を使用して \(\frac{{q_{{\mathrm{Chl}}}}}{{q_{\mathrm{C}}}}\) を推定します。これは、光制限された光合成独立栄養の成長速度を評価するために使用されます。

そこから \(\frac{{q_{{\mathrm{Chl}}}}}{{q_{\mathrm{C}}}}\) が再び更新されます。光制限された成長率は \(\frac{{q_{{\mathrm{Chl}}}}}{{q_{\mathrm{C}}}}\) を再評価するために使用されます。値が収束するまでこのシーケンスを繰り返すと、\({\Bbb V}_{\mathrm{C}}^{{\mathrm{auto}}}\) と \(\frac{{q_{{\mathrm{Chl} }}}}{{q_{\mathrm{C}}}}\) は反復的に解決されます。

固定窒素の窒素特異的取り込み速度 (1 日目) は次のようにモデル化されます。

ここで、最大摂取率の値 \({\Bbb V}_{\mathrm{N}}^{{\mathrm{max}}}\) と半飽和 KN は経験的なアロメトリックスケーリングから決定されます 35。 Bertilsson et al. 39 からの窒素セル割り当て QN とともに。

P 制限増殖速度、またはリン特異的なリン酸塩の取り込み速度 (1 日) は次のようにモデル化されます。

ここで、最大取り込み率の値、\({\Bbb V}_{\mathrm{P}}^{{\mathrm{max}}}\)。および半飽和 KP は、Bertilsson et al.39 からの窒素電池割り当て量 QP とともに、経験的なアロメトリックスケーリング 35 から決定されます。

鉄の取り込みは、Lis et al. に従って速度定数 (\(k_{{\mathrm{Fe}}}^{{\mathrm{SA}}}\)) をもつ細胞表面積 (SA) の一次関数としてモデル化されています。 36.

光、窒素、リン、鉄による潜在的な成長率 (\({\Bbb V}_{\mathrm{C}},{\Bbb V}_{\mathrm{N}},{\Bbb) V}_{\mathrm{P}}、{\Bbb V}_{{\mathrm{Fe}}}\)) は水柱の各深さで評価され、最小値は局所的にモデル化された光独立栄養成長速度です混合栄養性がないと仮定して推定します（図2b、d、青線）。この評価で使用されるパラメーターは補足表 2 にリストされています。

この研究の重要な前提は、非常に弱い光条件下での炭素不足は従属栄養によって補われているが、窒素は補われていないということである。プロクロロコッカスはアミノ酸を同化できることが知られており 9、したがって従属栄養性の寄与の化学量論によって解釈が変わる可能性があります。ただし、プロクロロコッカスがアミノ酸を滲出させる可能性があることも知られており 40、これによりプロクロロコッカスの化学量論に対する影響が打ち消される可能性があります。

局所的な環境条件からの光合成増殖速度の推定 (図 2) のために、プロクロロコッカス 24 の実験室培養からの光生理学的パラメーターを使用しました。この研究の目的のために、予測される光合成速度は純一次生産量であると仮定しました。これは、独立栄養呼吸が測定に考慮されていることを意味します。ただし、その研究でのインキュベーションは比較的短い時間スケール (45 分) であったため、おそらく総一次生産量をより代表していることを示唆している可能性があります。これが事実である場合、光独立栄養性の推定値は、独立栄養性呼吸を考慮するとさらに低くなり、したがって、従属栄養性炭素摂取によるより高い寄与が要求されることになります。この点で、私たちの推定値は有機炭素同化の下限と考えられるかもしれません。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

海洋学的測定値 (CTD データ、栄養塩濃度および細胞数) は、頭字語 HADFBA (データセット名「EMS 光ゾーン」) で BCO-DMO データベースに送信されています。生の ITS 配列は、BioProject PRJNA802335、アクセッション SAMN25553516-SAMN25553524 として GenBank から入手できます。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

R パッケージ Dada2 (v1.16) は、ITS シーケンスの処理に使用されます。 BLASTn を使用して ITS シーケンスを分析し、FloJo 10.5.3 を使用してフローサイトメーターデータを分析しました。独立栄養増殖速度を推定し、個別ベースのシミュレーションを実行するためのコードは、MIT ライセンスに基づく詳細な手順とともに Github (https://github.com/zhenwu0728/Prochromococcus_Mixotrophy) で入手できます。

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R/V 地中海探検家の船長と乗組員、海上での作業を手伝ってくれた T. Reich 氏、栄養素分析を手伝ってくれた M. Krom 氏と A. Tsemel 氏、バイオインフォマティクス分析を手伝ってくれた M. Ofek-Lalzar 氏に感謝します。 NanoSIMS のルーチン操作については A. Grüttmüller、時間ごとの PAR 推定については I. Tsakalakis、C 取り込み率についての議論については J. Casey が担当しました。この研究は、ヒューマンフロンティア科学プログラムからの助成金 RGP0020/2016 (MV、H.-PG および DS へ)、イスラエル科学財団からの助成金 1786/20 (DS へ)、およびイスラエル科学財団からの助成金番号 1635070/2016532 によって支援されました。海洋学における NSF-BSF プログラム (NSFOCE-BSF、DS まで)。ヴァルネミュンデ (IOW) にあるライプニッツ・バルト海研究研究所の NanoSIMS は、ドイツ連邦教育研究省 (BMBF) (助成金識別番号 03F0626A) から資金提供を受けました。 MJF と WZ は、海洋プロセスと生態学に関する Simons Collaboration (SCOPE 329108 to MJF) および海洋生態系の計算生物地球化学モデリングに関する Simons Collaboration (CBIOMES 549931 to MJF) を通じた Simons Foundation の支援に感謝しています。

これらの著者は同様に貢献しました: Zhen Wu、Dikla Aharonovich。

マサチューセッツ工科大学地球大気惑星科学科、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ

Zhen Wu & Michael J. フォローズ

ハイファ大学、レオン・H・チャーニー海洋科学部海洋生物学科、ハイファ、イスラエル

ディクラ・アハロノヴィッチ、ダリット・ロス＝ローゼンバーグ、オスナット・ワイスバーグ、タル・ルザット＝クナーン、ダニエル・シャー

ライプニッツ・バルト海研究所、ヴァルネミュンデ、ドイツ

アンジェラ・フォークツ、フォーク・アイゲマン、マレン・ヴォス

ライプニッツ淡水生態学および内陸水産研究所、実験陸水学部門、シュテクリン、ドイツ

ルカ・ゾッカラート & ハンス・ピーター・グロサート

ポツダム大学生化学生物学研究所、ポツダム、ドイツ

ハンス・ピーター・グロサート

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DA、DR-R.、TL-K.、AV、MV、DS が実験を計画、DR-R.、DA、TL-K.、LZ および DS が実験とフィールド分析を実施、DR-R.、DA、TL- K.、AV、FE は NanoSIMS 分析を実行し、DA、DR-R.、TL-K.、AV、LZ、FE、H.-PG、MV、DS は実験結果を分析しました。 ZW、MJF、OW、DS が成長率シミュレーションを設計および実行しました。 ZW は、個人ベースのモデルシミュレーションを設計および実行しました。 ZW、DA、DR-R.、TL-K.、MJF、DS は、すべての著者からの寄稿を受けて原稿を執筆しました。

Michael J. Follows または Daniel Sher への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Microbiology は、この研究の査読に貢献してくれたマリアデルカルメンムニョスマリン、ダミアンエヴェイヤール、および他の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

(a) フローサイトメトリー散布図の深さプロファイル。プロクロロコッカス集団の数をカウントするために使用されるゲートが示されています。 x 軸は 10° ～ 105 の任意単位の前方散乱光 (高さ)、Y 軸は 101 ～ 105 の任意の単位でのクロロフィル自家蛍光 (PerCP-Cy5、Ex=488、Em=680) です。標準的な蛍光ビーズも示されています。この分析による細胞数を図 1b に、蛍光ヒストグラムを図 1d に示します。 (b)、(c) nanoSIMS 分析前の 13C および 15N 標識プロクロロコッカス細胞のソートゲート。パネル B には、選別された画分の純度が示されています。目的は、共発生する部分集団を区別することではないため、125 m サンプルについては純度分析は実行されませんでした。

ソースデータ

青い線は、観察されたプロクロロコッカスの細胞密度を表します。青い破線は、式 (4) に基づいて観察された増殖速度から導出された細胞密度を表します。赤い線と赤い形状は、シミュレートされた細胞密度を表します。

ソースデータ

プロクロロコッカスの実験室研究では、たとえ有機炭素源が供給されたとしても、暗闇に長時間（数日を超えて）さらされても生き残ることができないことが示されています13,16。この偏性光栄養性をモデルで表すために、パラメーター \(f_{PS}^{min}\) は、光合成に由来する必要がある C の最小割合を表します (つまり、このパラメーターを 1% に設定すると、DOC の取り込みが停止することを意味します)光合成による寄与が 1% 未満の場合）。このパラメーターの値に対するモデル結果の感度を決定するために、光合成率の異なる要件 (赤の線は 1%、青の線は 5%、緑の線は 10%、黄色の線) を持つさまざまなシミュレーションのアセンブリを示します。要件なしの行）。 DOC の取り込みには C の総取り込みに対する光合成の少なくとも 1% の寄与が必要であるシミュレーションの組み立てを本文の図 3 に示します。予測される細胞密度は 1 ～ 10% の間のこのパラメーターの値に比較的鈍感ですが、このパラメーターがなければ、モデル化されたプロクロロコッカスはすべての深さで増殖できます。

ソースデータ

補足テキスト 1 および 2、表 1 ～ 3、および図 1。

個人ベースのモデルのシミュレーション。

統計ソースデータ。

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転載と許可

Wu、Z.、Aharonovich、D.、Roth-Rosenberg、D. 他。単一細胞の測定とモデリングにより、プロクロロコッカスによる実質的な有機炭素の獲得が明らかになりました。 Nat Microbiol 7、2068–2077 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41564-022-01250-5

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受信日: 2022 年 1 月 14 日

受理日: 2022 年 9 月 13 日

公開日: 2022 年 11 月 3 日

発行日：2022年12月

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-022-01250-5

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ネイチャー微生物学 (2022)